Строительство храма было инициировано в 1850 году Высочайше утверждённой Купеческой Конторой по устройству Урюпинской Покровской ярмарки. Каменное здание церкви было возведено с колокольней в едином ансамбле и окружено каменной оградой с железной решёткой. Главный престол был освящён в честь Рождества Христова, южный придел — во имя Покрова Пресвятой Богородицы, северный придел — во имя святого благоверного князя Александра Невского. При храме также имелась каменная часовня на кладбище, известном как Купеческое или Сивогривовское.
В 1886 году купец В.И. Серпуховитин построил и передал церковно-приходской школе здание, затратив на его строительство 5263 рубля. В приходе функционировали различные учебные заведения: реальное училище, открытое в 1877 году; женская гимназия, основанная в 1905 году; высшее начальное мужское училище, действовавшее с 1860 года.
В период гражданской войны, в августе 1919 года, часть духовенства храма покинула станицу вместе с эвакуирующимися белыми частями. В апреле 1920 года приходской совет получил распоряжение от отдела народного образования передать в центральную библиотеку все книги, кроме религиозных. В мае того же года община обратилась с просьбой о выделении материалов для ремонта кладбищенской ограды.
В 2004 году в Урюпинске был образован приход Рождества Христова. Молитвенный дом разместился в старинном здании, которое постепенно приводилось в порядок для проведения богослужений и других церковных мероприятий.