В начале XX века в Барнауле дислоцировался стрелковый полк, что обусловило необходимость строительства полкового храма для духовного окормления военнослужащих. 18 апреля 1903 года городская дума рассмотрела вопрос о выделении земельного участка под строительство церкви. Несмотря на ограниченность свободных территорий, было решено предоставить участок площадью 290 квадратных саженей на пересечении Московского проспекта (ныне проспект Ленина) и Второй Алтайской улицы, в непосредственной близости от полковых казарм.
Строительство храма началось в 1904 году и велось по типовому проекту военных церквей, разработанному архитектором Фёдором Михайловичем Вержбицким и утверждённому Строительной комиссией в 1901 году. Под наблюдением местного архитектора Ивана Фёдоровича Носовича здание было возведено из красного кирпича в стиле эклектики с элементами русско-византийского зодчества. Храм представляет собой однонефное базиликальное сооружение с трёхъярусной колокольней и торжественным порталом на западном фасаде, рассчитанное на 400–600 человек.
9 февраля 1906 года состоялось освящение храма, после чего он стал центром духовной жизни для военнослужащих и местных жителей. Здесь проходили присяги новобранцев, а в 1912 году у стен церкви состоялись торжества, посвящённые 100-летию победы в Отечественной войне 1812 года.
В 1930-х годах, в период антирелигиозной политики советской власти, храм был закрыт. С него сняли купола, разобрали колокольню, а здание переоборудовали под клуб для военной части, позднее используемый Барнаульским высшим военным авиационным училищем лётчиков.
В мае 1991 года, после визита Патриарха Московского и всея Руси Алексия II, здание храма было возвращено Русской Православной Церкви. К маю 1993 года в храме возобновились богослужения, а в последующие годы проводились реставрационные работы. Была восстановлена колокольня, установлен новый двухъярусный иконостас, созданный палехскими мастерами, а внутренние росписи выполнены барнаульским художником В. Коньковым.
В июне 2006 года завершилась реконструкция первого купола, а 21 мая 2007 года на храм были установлены пять золочёных крестов: один над центральным входом и по два с каждой стороны.
В мае 2023 года возле входа в храм был установлен и освящён памятник святителю Николаю Чудотворцу, созданный скульптором Сергеем Исаковым и отлитый на средства мецената Валерия Лукьяненко. Памятник выполнен из бронзы и латуни, его высота вместе с постаментом составляет шесть метров, а вес — около трёх тонн.
