Согласно Псковским летописям, в 1487 году, во время эпидемии мора, жители Пскова в один день возвели деревянную церковь во имя святой Анастасии на Полонище, на Кузнецкой улице, на участке, предоставленном посадником Яковом. В тот же день храм был освящен и в нем совершена первая Божественная литургия.
Каменная церковь на месте деревянной была построена до 1538 года, о чем свидетельствует упоминание в летописи о пожаре, в результате которого пострадала каменная церковь святой Анастасии. В 1639 году к основному объему храма был пристроен придел во имя святой великомученицы Параскевы Пятницы.
В 1745 году церковь была приписана к храму Василия Великого на Горке. В 1786 году, после пожара, церковь была назначена к упразднению как полуразрушенная, но в 1787 году решением Псковской духовной консистории оставлена и приписана к Ново-Вознесенской церкви. В 1819 году ветхая звонница и крыльцо были заменены на новую трехъярусную колокольню с каменным крыльцом.
В 1842 году, по инициативе настоятеля Ново-Вознесенской церкви протоиерея Николая Милевского, начался сбор средств на восстановление храма. В 1844 году обновленный храм был освящен в честь святой великомученицы Анастасии Узорешительницы. В последующие годы были проведены работы по улучшению состояния храма: заменена крыша, установлен новый иконостас, проведено электрическое освещение.
В 1932 году храм был закрыт, и его помещения использовались под книгохранилище Псковской областной библиотеки. В годы Великой Отечественной войны здание получило частичные повреждения. В 1960 году храм был взят под охрану государства как памятник республиканского значения.
