Согласно историческим данным, Богоявленская церковь существовала уже в первой половине XVI века. В Сотной переписи серпуховского посада 1552 года, проведённой князем Василием Семёновичем Фуниковым, храм упоминается как центр развитой части города — Богоявленского конца. Вокруг него располагались 16 дворов зажиточных горожан, преимущественно кожевников, и 30 дворов менее обеспеченных посадских жителей, также занятых в кожевенном ремесле, а также казаков, мясников и сапожников. Незадолго до переписи к Богоявленской части посада присоединилась бывшая слободка, где проживали кожевники, кузнецы и торговцы.
Современное здание храма было возведено в 1713 году на средства прихожан. 3 июля того же года был издан указ о строительстве храма Богоявления с приделом Рождества Богородицы, а уже через три дня — указ об их освящении. Это свидетельствует о том, что строительство велось оперативно и, возможно, было начато ранее официального разрешения.
В 1761 году на средства серпуховского купца Алексея Ивановича Остапова с северной стороны храма был устроен придел во имя святителя Димитрия Ростовского, канонизированного в 1757 году. В 1870 году придел Рождества Пресвятой Богородицы с южной стороны храма был расширен стараниями купца Семёна Семёновича Астапова. Семейство Астаповых, владельцев близлежащего кожевенного завода, на протяжении многих десятилетий являлось ктиторами и старостами Богоявленского храма, оказывая значительную поддержку в его развитии и благоустройстве.
Архитектурно Богоявленский храм представляет собой типичную посадскую церковь типа «восьмерик на четверике» с пристроенными с запада трапезной и колокольней. К трапезной примыкали два обширных придела, что придавало зданию форму неправильного греческого креста. Алтарная часть в виде полукружия по площади почти равнялась четверику. Храм выделялся своей обширностью и высотой шатровой колокольни с четырьмя ярусами слухов. Построенная из кирпича церковь была украшена лепными карнизами, наличниками окон под килевидными фронтонами, лопатками по граням восьмерика, горизонтальным поясом на северном приделе и колонками на западном фасаде. На стене южного придела, в нише, находилось живописное изображение Рождества Богородицы. Стены храма были побелены, кровли, главы, барабан и шатёр колокольни окрашены. По описанию 1887 года, кровли были зелёного цвета, главы — синего, крест на храме был позолочен, а на колокольне — окрашен в жёлтый цвет. Внутри храм был расписан, а шестиярусный иконостас с резным растительным орнаментом, вероятно, XVIII века, считался одним из самых замечательных в городе.
Приход Богоявленского храма с давних времён включал не только часть Серпухова, но и ряд населённых пунктов к северо-западу от города по правому берегу реки Нары: деревни Глазечня, Гавшино и Злобино, сельцо Мокрово, сельца Пущино и Тверетиново. С начала XVII по начало XX веков храм духовно окормлял селения, удалённые от него на расстояние до 8,5 км. В 1826 году в его приходе насчитывалось 137 дворов, 718 мужчин и 726 женщин; в 1860 году — 135 дворов, 718 мужчин и 806 женщин; в 1917 году — 217 дворов, 1043 мужчины и 1120 женщин.
В 1839 году прихожанке Богоявленской церкви, статской советнице Наталье Алексеевне Донауровой (урождённой Хитрово), было разрешено устроить домовую церковь в её усадьбе в сельце Пущино-на-Наре. В 1841 году разрешение было возобновлено для новой владелицы Пущина — вдовы генерал-майора Александры Петровны Потаповой. Домовый храм во имя Покрова Богородицы действовал с 1843 по конец 1847 года.
