Первое летописное упоминание о Холковском монастыре относится к 1620 году. Основание обители связывают с иноком Геласием. Монастырь располагался на террасе мелового холма вблизи впадения реки Холок в Оскол. Подземные сооружения включали кельи, вырубленные в меловой породе, и храмовый комплекс. Архитектурное решение пещер демонстрирует сходство с Киево-Печерской лаврой.
В 1653 году монастырь получил жалованную грамоту от царя Алексея Михайловича на безоброчное владение мельницей. В 1666 году для защиты от набегов была сооружена сторожевая башня, входившая в систему Белгородской засечной черты. В 1757 году построена деревянная надвратная часовня, позднее перестроенная в церковь.
В 1764 году монастырь был упразднен согласно Манифесту о секуляризации монастырских земель. Преображенский храм, возведенный в 1650-х годах, стал приходским. Попытка возобновления пещерного комплекса предпринималась в 1830-х годах князем А.Б. Голицыным, но не увенчалась успехом.
В XX веке вход в пещеры был утрачен. В 1990 году начались работы по расчистке завалов под руководством местного жителя Василия Пономарева. 14 октября 1990 года состоялось освящение подземного Свято-Троицкого храма. Богослужения возобновились в 1995 году.
В 1997-1999 годах построены новые храмовые сооружения: надвратный храм преподобных Антония и Феодосия Киево-Печерских, Владимирская часовня и храм Донской иконы Божией Матери. 28 декабря 1999 года Священный Синод Русской Православной Церкви принял решение об официальном открытии монастыря.
Среди исторических артефактов сохранился список Казанской иконы Божией Матери, обнаруженный в колодце около 1740 года. Икона датируется началом XVII века, о чем свидетельствуют исследования реставраторов.