Храм Всех Святых в Симферополе был основан в 1864 году на средства купца Василия Борисовича Масленникова. Первоначально освящен 14 июня 1864 года в честь Успения праведной Анны, позднее переосвящен во имя Всех Святых. Церковь была приписана к кафедральному Александро-Невскому собору, откуда в нее перенесли деревянный резной иконостас.
В 1901 году при храме открылась школа грамоты с четырехгодичным сроком обучения. В 1912-1913 годах построена колокольня, освященная 9 июня 1913 года епископом Димитрием (Абашидзе). Храм выполнен в классическом стиле: прямоугольное здание с полукруглой апсидой, центральным куполом и западной колокольней.
В советский период храм не закрывался, хотя 9 марта 1922 года из него были изъяты церковные ценности. С 1939 по 1941 год он оставался единственным действующим храмом в Крыму. 15 июня 1944 года в храме через покаяние были воссоединены с Русской Православной Церковью крымские священнослужители старого рукоположения.
В 1998 году во время реставрационных работ в приделе великомученика Георгия Победоносца было обнаружено нерукотворное изображение Христа Спасителя на стекле киота. Комиссия экспертов подтвердила нерукотворный характер изображения, представляющего собой тонкий налет из органических кислот и воска.
На прихрамовой территории находятся захоронения церковных деятелей, включая епископа Таврического Михаила (Грибановского), архиепископов Гурия (Карпова) и Луку (Войно-Ясенецкого). В 2023 году при храме открылся музей «Христианский Симферополь», где представлены богослужебные предметы XVIII-XX веков.