Первые упоминания о храме на этом месте относятся к началу XVII века. До 1612 года здесь стояли две деревянные церкви — Вознесения Господня и Богоявления. Обе были уничтожены во время польско-литовской интервенции. В 1624 году Вознесенская церковь была восстановлена, а к 1709 году на этом месте вновь стояли два храма. Богоявленская церковь сгорела в 1725 году и более не восстанавливалась.
В 1751 году началось строительство каменного храма. Сначала был возведен и освящен придел Богоявления, а в 1760 году — главный престол. 19 мая 1763 года храм сильно пострадал во время городского пожара, но был восстановлен: придел Богоявления — к сентябрю того же года, а весь храм — к 1768 году. В 1805 году к храму пристроили колокольню.
В 1818 году рассматривался проект полной перестройки храма, но он не был реализован. Вместо этого в 1826-1836 годах храм был значительно перестроен по проекту архитектора И.Ф. Львова в стиле позднего классицизма. В 1831 году был освящен придел преподобных Антония и Феодосия Печерских, в 1833 году — главный престол, а в 1836 году — придел Богоявления.
В 1922 году из храма были изъяты церковные ценности, а в 1935 году он был закрыт. С 1936 года в здании размещалась экспозиция областного краеведческого музея. В октябре-декабре 1941 года, во время немецкой оккупации, в храме временно возобновились богослужения. В 1972 году здание было передано под выставочный зал, что потребовало значительной перестройки внутренних помещений.
В 1991 году начался процесс передачи храма Русской Православной Церкви. 7 января 1993 года в нем возобновились богослужения. В 1994 году в храм были перенесены обретенные в 1993 году мощи священномученика Фаддея (Успенского), архиепископа Тверского. В том же году возобновилась традиция крестного хода с Тихвинской иконой Божией Матери из Христорождественского монастыря в Вознесенский собор.