Является первой православной церковью города, построенной между 1780 и 1782 годами.
Первоначально храм был устроен в Кухонном каре дворца по инициативе графа Григория Орлова, фаворита императрицы Екатерины II, для обеспечения духовного окормления обитателей дворца.
В период правления императора Павла I, который получил Гатчинский дворец в 1783 году, храм претерпел значительные изменения. Были добавлены царское место, новый иконостас, а стены и плафоны украшены росписями. 12 октября 1799 года в храм были перенесены святыни Мальтийского ордена: часть древа Животворящего Креста Господня, Филермская икона Божией Матери и десница святого Иоанна Крестителя. В этот же день состоялось бракосочетание великой княжны Елены Павловны, а 19 октября — великой княжны Александры Павловны.
В 1844 году, во время царствования Николая I, архитектор Роман Кузьмин осуществил капитальную перестройку храма. Интерьер был оформлен в стиле ренессанс: появились шесть высоких окон, арочные проёмы с лепниной, колонны из искусственного мрамора и ажурная кованая решётка. Эти изменения придали храму светлый и торжественный вид, не имеющий аналогов в культовом зодчестве того времени.
После Октябрьской революции 1917 года храм был закрыт, а его помещения использовались под библиотеку различных организаций, занимавших дворец. В 1999 году, к 200-летию перенесения мальтийских святынь, в храме было проведено первое богослужение. В 2003 году зарегистрирована православная община, и храм вновь стал действующим.
В 2016 году храм закрыли для проведения реставрационных работ, завершившихся 17 мая 2023 года, после чего он вновь открыт для посетителей.
